2024年7月，發(fā)表在《Nature Communications》的一篇文章“A gene desert required for regulatory control of pleiotropic Shox2 expression and embryonic survival"，聚焦Shox2基因下游的基因沙漠，綜合運用多種前沿技術，揭示了基因沙漠在調控Shox2基因多效性表達、胚胎存活及組織發(fā)育中的關鍵作用。該研究中，ATAC-seq技術發(fā)揮了重要作用。它通過檢測染色質的可及性，幫助研究人員篩選出在心臟組織中特異性開放的染色質區(qū)域，進而定位到Shox2基因沙漠中的心臟特異性增強子（+325）。這一發(fā)現(xiàn)不僅明確了基因沙漠中調控心臟 Shox2表達的關鍵元件，也為解析基因沙漠在心臟發(fā)育中的調控機制提供了關鍵線索，推動了對基因調控網(wǎng)絡復雜性的認知。

研究背景

約四分之一的人類基因組由基因沙漠組成，這些區(qū)域沒有基因，但卻常常位于發(fā)育基因附近，暗示著它們可能參與基因調控。此前研究表明部分基因沙漠有重要作用，但多數(shù)基因沙漠功能仍不明確。Shox2基因對小鼠胚胎發(fā)育至關重要，其編碼的轉錄因子影響近端肢體、顱面、心臟起搏器等發(fā)育，且人類Shox2相關變異與心臟疾病有關。本研究聚焦于Shox2基因下游的穩(wěn)定基因沙漠，探究其對基因表達調控及胚胎發(fā)育的作用。

技術路線

研究結果

1.研究發(fā)現(xiàn)，基因沙漠中存在多個具有組織特異性活性的增強子。通過LacZ轉基因報告分析，這些增強子在肢體、顱面、神經(jīng)和心臟等組織中表現(xiàn)出與Shox2基因表達模式高度重合的活性。這表明基因沙漠中的增強子在調控Shox2基因的多效性表達方面發(fā)揮著重要作用。

圖1. Shox2基因沙漠是組織特異性增強子的樞紐。

2.利用C-HiC對小鼠胚胎的前肢、下頜骨和心臟組織進行分析，結果顯示，Shox2基因沙漠形成了具有組織特異性特征的染色質環(huán)。在心臟組織中，存在一個高密度接觸域（HCD），它影響著增強子與啟動子之間的相互作用。以Shox2轉錄起始位點為中心，利用v4C分析它與其他元件的接觸情況，進一步揭示增強子與啟動子之間的遠程相互作用。這說明染色質的三維結構在基因調控中起著關鍵作用，基因沙漠通過塑造特定的染色質環(huán)來調控Shox2基因的表達。

圖2. 在不同組織中調控Shox2的3D染色質結構。

3.研究人員進一步構建了基因沙漠缺失的小鼠模型，通過整體原位雜交（ISH）、qPCR、免疫熒光（IF）、骨骼染色和μCT技術檢測基因表達以及肢體骨骼發(fā)育的情況。結果顯示基因沙漠缺失導致胚胎致死，心臟竇靜脈（SV）中Shox2轉錄本缺失，同時顱面和近端肢體中Shox2表達也顯著降低。這直接證明了基因沙漠對于維持胚胎存活以及調控Shox2在不同組織中的表達量至關重要。

圖3. 基因沙漠缺失減少了肢體和顱面隔室中的Shox2。

4.通過ATAC-seq與ChIP-seq聯(lián)合分析，研究人員在基因沙漠中鑒定出一個關鍵的心臟增強子（+325）。同時通過雙熒光素酶報告實驗驗證了這個增強子與TBX5轉錄因子相互作用，維持心臟中Shox2的穩(wěn)定表達。當這個增強子缺失時，心臟中Shox2的表達量下降，進一步說明了基因沙漠增強子對心臟Shox2表達的重要調控作用。

圖4. 基因沙漠介導的心臟Shox2轉錄調控對胚胎存活至關重要。

5.結合ChIP-seq和4C-seq數(shù)據(jù)分析，并通過多增強子聯(lián)合缺失實驗，發(fā)現(xiàn)基因沙漠中包含多個近端肢體增強子（PLEs），這些增強子在肢體發(fā)育過程中相互協(xié)作。同時發(fā)現(xiàn)基因沙漠缺失會導致肢體骨骼發(fā)育異常，Stylopod（肱骨和股骨）嚴重縮短。這充分表明基因沙漠在肢體形態(tài)發(fā)生過程中扮演著重要的角色。

圖5. 增強子介導的轉錄穩(wěn)定性保護心臟中的Shox2。

圖6. 基因沙漠編碼了一系列具有亞區(qū)域特異性的分布于近端肢體的增強子（PLEs）。

Shox2基因沙漠是關鍵的順式調控區(qū)域，編碼一系列組織特異性增強子，協(xié)調調控Stylopod 形成、顱面模式形成和心臟起搏器依賴的胚胎發(fā)育進程。其增強子的組織特異性和分布模式，以及染色質拓撲結構對理解先天性異常的發(fā)病機制具有重要意義，為后續(xù)研究提供了理論基礎和方向。