近日，北京市農林科學院玉米DNA指紋及分子育種北京市重點實驗室、齊魯師范大學玉米分子育種研究院的共同研究成果，于2022年7月5日在Theoretical and Applied Genetics上發表(影響因子為5.574)，題目為“ A newly characterized allele of ZmR1 increases anthocyanin content in whole maize plant and the regulation mechanism of diferent ZmR1 alleles"。本文主要研究內容是鑒定了玉米花青素合成相關等位基因ZmR1CQ01，并揭示了3個ZmR1等位基因的生物學功能和分子調控機制。

研究背景

玉米中的花青素對人類的健康具有積極作用。R1基因家族調控花青素的組織特異性分布。R1基因的等位基因變異較為豐富，然而其生物學功能和分子調控機制尚不清楚。

研究材料

玉米自交系 CQ01、ZN3、B73、B104、WMR，京紫糯219 (ZN3×CQ01)，京724，京92、京科968 (京724×京92)，B73 zmr1 EMS突變體，以及本研究中用到的多個遺傳材料。

研究結果

CQ01玉米植株的多種器官(葉鞘、葉脈、苞片、葉、莖、種子皮、支撐根等) 中都存在花青素色素沉著現象。然而B73植株的花青素主要積累在近地葉鞘和支撐根中。

圖1：玉米自交系CQ01葉片中脈花青素含量和成分分析以及花青素調控基因的定位

(a)玉米自交系CQ01和B73的葉中脈。(b) CQ01生長30天后葉中脈的花青素含量。© LC-MS/MS在不同掃描波長下的信號強度。(d) LC-MS/MS檢測花青素的保留時間和信號強度。(e) 花青素組成成分檢測。(f)BSR-seq分析將花青素調控基因定位到10號染色體 (B73 RefGen_v3)。(g) 采用滑動窗口法將花青素調控基因定位到10號染色體132-140Mb區間。(h) 利用CQ01(紫色中脈)和ZN3(綠色中脈)之間具有SNP多態性的13個KASP分子標記，對465個京紫糯219 (ZN3×CQ01)的F2代個體進行精細定位，將葉中脈花青素調控基因定位于KASP-15和KASP-19標記之間的404kb區間。

通過CQ01和B73雜交的F2代種群分離實驗 (綠色中脈:紫色中脈=1:3) 發現，CQ01的紫色葉中脈由一個顯性基因控制。通過BSR-seq分析及精細遺傳定位發現玉米葉中脈的花青素色素沉著由第10號染色體上的ZmR1基因控制。

圖2：過表達ZmR1和過表達ZmR1CQ01的京724的不同組織中花青素的積累

(a) ZmR1過表達載體的結構。(b) 野生型京724和5個獨立的過表達ZmR1CQ01的京724(T0代)中花青素積累的表現型。(c-m) 野生型京724和過表達ZmR1CQ01的京724的不同組織中的花青素積累。花青素在玉米粒©、胚芽鞘(d和e)、玉米須(f和j)、苞片(f和j)、葉(g和k)、葉中脈(g和k)、葉鞘(h和l)、莖(h和l)、花藥(i和m)和雄花序(i和m)中積累。

圖3：玉米zmr1 EMS突變體的等位基因檢測及ZmR1的亞細胞定位

(a) 3個B73 zmr1 EMS突變體的突變位點和核苷酸變異情況。(b) 突變位點測序結果。(c-d) 野生型B73、3個B73 zmr1 EMS突變體©、2個突變體雜交植株和CQ01(d)的葉鞘中花青素積累的情況。(e) 通過對玉米原生質體的瞬時表達分析ZmR1的亞細胞定位。

玉米zmr1 EMS突變體的等位基因檢測表明，葉鞘中的花青素色素沉著也受到ZmR1的控制。

圖4：玉米自交系B73的葉鞘和葉片中花青素的積累和ZmR1的表達，以及在B104中過表達ZmR1B73后，葉中脈花青素積累增加

(a-b) B73和CQ01在葉鞘(a)和中脈(b)中的花青素積累。© B73生長30天后葉鞘中花青素的含量。(d)在生長30天的B73、CQ01和B73 zmr1 EMS突變體的葉鞘(靠近地面)、葉片和中脈中ZmR1的表達水平。(e)通過轉錄組分析鑒定生長30天的CQ01和B73葉中脈中ZmR1的FPKM值。(f) 生長30天的野生型B104和過表達ZmR1B73的轉基因B104中花青素色素沉著的比較。(g-h) 過表達ZmR1B73的轉基因B104和過表達ZmR1CQ01的轉基因B104在生長30天時花青素色素沉著的比較。

ZmR1B73等位基因調控花青素在近地葉鞘中積累，而在葉片中脈沒有積累。ZmR1B73在中脈的mRNA表達水平較低，因而沒有花青素積累。過表達ZmR1B73可以促進花青素在中脈的積累。

圖5：ZmR1ZN3的功能驗證和功能分子標記物的開發

(a) 花青素不在ZN3的葉鞘和中脈積累。(b) 生長30天的ZN3和CQ01的葉片、中脈和葉鞘中ZmR1的表達量比較。© 通過zmr1 EMS突變體等位基因測試驗證ZmR1ZN3的功能。(d) ZN3和CQ01的序列比對顯示，在ZN3中缺失了ZmR1的第5個外顯子。(e) ZmR1可編碼三個保守結構域，其中bHLH-MYCN結構域由第5個外顯子編碼。(f) CQ01、ZN3和京紫糯219 (ZN3×CQ01)中分子標記的擴增片段大小。CQ01為315 bp，ZN3為272 bp，京紫糯219為272 bp和315 bp。(g) 玉米自交系WMR的分子標記鑒定結果與觀察到的表型一致。利用所開發的分子標記，對432個田間玉米自交系進行了鑒定。WMR的擴增片段為272 bp。表型分析顯示，WMR的葉鞘和中脈缺乏花青素的積累。

對ZN3和CQ01的序列比較顯示，在ZN3中缺失了ZmR1的第5個外顯子，導致ZmR1ZN3等位基因功能被破壞，因而在中脈和葉鞘中沒有花青素積累。

圖6：DAP-seq鑒定的ZmR1靶基因和RNA-seq鑒定的差異表達基因(DEGs)富集的代謝途徑

(a)ZmR1結合的置信度高的兩種motifs,“GATCAATGGCCA"和“GAGGWGTMBGWG"的motifs E值分別是 4.6e-311和1.3e-268。(b) 由DAP-seq鑒定的ZmR1的靶基因富集的前20個代謝途徑。© RNA-seq分析CQ01和B73的中脈，鑒定了DEGs富集的前20個代謝途徑。(d) RNA-seq分析野生型和過表達ZmR1CQ01的京724的葉片，鑒定了DEGs富集的前20個代謝途徑。

DNA親和純化測序(DAP-seq)結果顯示，ZmR1CQ01靶向了1010個基因，其中包括花青素合成途徑中的Bz2。RNA-seq分析顯示，ZmR1CQ01靶向的55個基因的表達水平顯著改變，其中類黃酮和苯丙素生物合成途徑中關鍵酶的基因表達顯著上調。隨后，又開發了ZmR1功能分子標記物。以上結果揭示了轉錄調控和序列變異對ZmR1功能的影響，并在全基因組水平上鑒定了ZmR1CQ01的靶基因。

圖7：過表達ZmR1CQ01玉米京724的應用

(a) 過表達ZmR1CQ01京724植株由綠色變為紫色。(b)過表達ZmR1CQ01京724的紫色玉米將白酒變為紅色。© 過表達ZmR1CQ01京724和京92雜交得到的田間玉米雜交種京科968植株是紫色的。

本文小結

本研究在玉米自交系CQ01的葉中脈中克隆了新的ZmR1等位基因。通過利用玉米EMS突變體、過表達ZmR1基因、分析序列差異、組織特異性表達分析、啟動子甲基化水平分析、轉錄組和DAP-seq結果，揭示了ZmR1在多種組織中對花青素分布的影響及其分子調控機制。

通過分子育種策略，可以產生高花青素含量的玉米品系。過表達ZmR1CQ01，獲得了一個花青素含量高的紫色玉米雜交種京科968。本研究開發的新R等位基因ZmR1CQ01及其功能分子標記，可通過分子標記輔助育種用于高花青素含量玉米新品種的遺傳改良和分子設計育種。

藍景科信河北生物科技有限公司為作者提供了DAP-seq技術支持。